结晶紫法活性测定

　　1、取对数生长期的人胰腺癌SW1990细胞，用0.25%胰酶(以无钙镁离子PBS溶液配制，pH7.4)消化后，加进RPMI-1640培养基(10%新生牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素，pH7.2)奏乐细胞，使形成细胞悬液。进行细胞计数，使细胞数为2~2.5×105个/ml。接种于96孔细胞培养板，100μl/孔。接种细胞时须不断摇动细胞悬液，以保证各孔细胞数的均匀一致。96孔板放置于37℃、5%CO2培养箱中培养22h，观察到孔中细胞长满70~80%。

　　2、在上述RPMI-1640完全培养基中加进放线菌素D，使终浓度为1.5μg/ml，配成样品稀释液。取此稀释液900μl至Eppendorf管中，另在9个5ml管中加进700μl稀释液。

　　3、用完全培养基将基因工程人肿瘤凋亡素样品(上海恰尔生物技术有限公司研制，批号：0304，冻干粉剂，蛋白浓度：2mg/支)复溶至1000μl(液体样品测定蛋白浓度后，直接进行下一步操纵)，取出100μl至已装有900μl稀释液的Eppendorf管中，充分混匀，尽量不起泡沫。再从此管中吸出100μl至下一管中，如此反复n次(即测定前10倍稀释若干次，直到与估计活性相接近时)。

　　4、从最后稀释的Eppendorf管中吸出700μl样品至已装有700μl稀释液的5ml管中，充分混匀。再从此管中吸出700μl至下一管同样装有700μl稀释液的5ml管中，如此反复9次(即测定时倍比稀释样品)。

　　5、弃往96孔板中旧的培养基，从第一个5ml管中吸取已稀释的样品100μl至第2排细胞孔中，每个稀释度作6复孔(n=6);从第二个5ml管中吸取的样品加进第3排细胞中，依此类推，直至第10排孔结束。第1排中不含细胞，加进100μl/孔含有放线菌素D的稀释液作空缺对照;第11排加100μl/孔稀释液作细胞对照;第12排加不含放线菌素D的RPMI-1640完全培养基。

　　6、将加好样品的96孔板置37℃、5%的CO2培养箱中继续培养22h，显微镜下观察细胞形态变化，初步判定结果。

　　7、弃除培养板中的培养基，每孔加进100μl染色液(1.5mmol/L结晶紫)染色30min。洗往染色液，甩往水分并在吸水纸上拍打以使干燥。冲洗程度以在吸水纸上拍打时，没有颜色出现为宜。

　　8、充分干燥后，每孔加进100μl33%浓度的冰醋酸，在振荡仪上充分振荡使结晶溶解。设定λ=595nm酶联检测仪测定各孔的吸光值，据此数据进行统计学处理，计算出对细胞50%杀伤时所需的基因工程人肿瘤凋亡素的浓度。

　　[活性计算]

　　活性单位定义：在上述测定条件下，以50%SW1990肿瘤细胞被杀伤时，为基因工程人肿瘤凋亡素的1个活性单位。

　　1、样品的稀释度取常用对数。

　　2、根据对应的细胞毒活性(光密度值)与稀释度的对数，进行线性回回，得到计算公式y=ax b，分析相关系数R值，符合统计学要求者进行下一步分析。

　　3、代进50%杀伤时的光密度值(即第11排细胞光密度值的一半)，计算出稀释倍数的对数，再求出稀释倍数。

　　4、根据原样品浓度及稀释倍数计算出基因工程人肿瘤凋亡素对细胞50%杀伤时的浓度，再算出比活性。

　　5、其他细胞的检测方法同上，计算时根据对SW1990标定的基因工程人肿瘤凋亡素活性单位，先求出对细胞50%杀伤时的所需活性单位，再根据基因工程人肿瘤凋亡素对SW1990细胞杀伤的比活性算出相应的尽对量。

　　[计算结果]

　　0304批原液：比活为：1.03×107活性单位/mg

　　蛋白的生物活性及结构测定方法

　　生物活性测定[37,38]是将人胰腺癌1990细胞以2×105个/ml种进96孔细胞培养板，37℃5%CO2培养箱培养4-6小时，用完全培养液(加有1.2μg/m的放线菌素D)做梯度稀释的样品加进细胞板(n=3)。置37℃5%CO2培养箱，18h后弃上清，以结晶紫固定液(结晶紫0.5%，甲醛8%，NaCl0.1%，乙醇20%)染色15min，蒸馏水洗往结晶紫。每孔再加进200μ33%的乙酸，旋涡混匀，置酶联仪读出D(595)值，以未加细胞的空缺孔为D本底。根据活性单位定义：使培养孔中的细胞50%死亡为一个单位。

　　MTT法——活性测定

　　1、接种细胞：用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，以每孔103-104个细胞接种于96孔板中，每孔体积200μl。

　　2、培养细胞：将培养板移进CO2培养箱中，在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下，培养3-5天。(培养时间取决于实验目的和要求)

　　3、呈色：培养第3-5天后，每孔加进MTT溶液(5mg/mL)20μl，37℃，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养液上清。每孔加进150μlDMSO(二甲基亚砜)，振荡10min，使结晶物充分溶解。

　　4、比色：选择490nm波长，在酶标仪上测定个孔吸收值，记录结果。